牛冠狀病毒（Bovine Coronavirus，BCoV）屬于冠狀病毒科，冠狀病毒屬
2a 亞群，是引起新生犢牛腹瀉、成年牛冬痢和呼吸道感染的重要病原。流行病學(xué)
調(diào)查表明，牛冠狀病毒在牛場中普遍存在，主要通過消化道和呼吸道傳播，感染
的牛長期帶毒并在一定時期內(nèi)持續(xù)排毒，易造成牛群的大范圍感染。因此，對帶
毒牛的及時檢出和牛場環(huán)境監(jiān)測就顯得尤為重要。本產(chǎn)品就是專門用于牛冠狀病
毒的快速熒光 RT-PCR 檢測的試劑盒，在毒?；蚺霏h(huán)境的檢測領(lǐng)域有廣泛用
途，它具有下列特點：
1. 即開即用，用戶只需要提供病毒 RNA 模板。
2. 使用 RNase H 已經(jīng)突變的 SuperMMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶，減少了 RT 過程中 RNA
的降解。
3. 使用熱啟動的 Taq DNA 聚合酶，降低了非特異性擴(kuò)增。
4. 熒光定量檢測，所含 SYBR Green I 只與雙鏈 DNA 結(jié)合，反應(yīng)特異性強(qiáng)。適
用于不需要 ROX 做校正染料的熒光 PCR 儀。
5. 產(chǎn)品的有效線性范圍廣，定量更加準(zhǔn)確。
6. 引物經(jīng)過優(yōu)化，特異性高，不會誤檢牛輪狀病毒（BRV）、牛病毒性腹瀉病毒
（BVDV）和牛流行熱病毒（BEFV）等常見牛類病毒。
7. 引物是根據(jù)保守的 N 基因設(shè)計，產(chǎn)物長度為 100 bp。

運輸及保存:

使用方法:

一、樣品 RNA 的制備 
用自選方法純化 BCoV 樣品的 RNA，也可以另購本公司的一管式病毒
RNAout 或柱式病毒 RNAout，上述兩款產(chǎn)品跟本試劑盒兼容。
二、RT（逆轉(zhuǎn)錄）反應(yīng)合成 cDNA
按照下表配制 RT 反應(yīng)體系（20 uL 體系）：
成份 用量
RNA 模板（自備） 由于一般不知病毒RNA濃度,用1-10 uL即可
BCoV 專一性引物二 2 uL
RNase-free 水 補(bǔ)水到 13 uL
70℃保溫 5 min 變性模板后立即冰浴。
RT Buffer(含 dNTP) 5 uL
37℃保溫 5 min。
SuperMMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶 2 uL
42℃保溫 60 min。此步為 RT 反應(yīng)。
70℃保溫 10 min 以終止反應(yīng)，然后放置在冰上待用。合成的 cDNA 可以
直接作為 PCR 模板使用，不需要純化。
三、設(shè)置熒光 PCR 反應(yīng)（50 uL 體系）
1. 配制 8-10 個濃度范圍的標(biāo)準(zhǔn)品：用 DNA 稀釋液將 BCoV 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成 8-10
個濃度，待用。
2. 在 PCR 管中加入下列成分（N 跟據(jù)稀釋度由客戶自己決定）：
成 份 樣品
標(biāo)準(zhǔn)品
（8-10 管）
陰性對照
2×qPCR Mix 25 uL 25 uL 25 uL
cDNA 樣品（上步的 RT 反應(yīng)液） 1-5 uL 無 無
標(biāo)準(zhǔn)品(8-10 個濃度) 無 N uL 每管 無
BCoV 專一性引物一 2 uL 2 uL 2 uL
BCoV 專一性引物二 2 uL 2 uL 2 uL
補(bǔ)水到 50 uL
3. 上機(jī)進(jìn)行 PCR。熒光定量 PCR 反應(yīng)參數(shù)為（以 ABI7500 熒光定量 PCR 儀
為參考）:
過程 溫度 時間
預(yù)變性（此步用于活化熱啟動 Taq 聚合酶） 95℃ 30 s
PCR 反應(yīng)
（35-40 個循環(huán)）
95℃ 5 s
60℃ 30 s
72℃ 10 min
熔解曲線分析
95℃ 5 s
65℃ 1 min
95℃ 15 s
50℃ 30 s
4. 根據(jù) 8-10 個標(biāo)準(zhǔn)品的 Ct 值（X 軸）和濃度（X 軸）描出標(biāo)準(zhǔn)曲線，用待測
樣品 Ct 值推出其濃度。