Western Blotting技術(shù)服務(wù)

WESTERN BLOT是以電泳分離組分，將其從凝膠轉(zhuǎn)移到一種固相支持體，繼之以針對(duì)特定氨基酸序列的特異性抗體作為探針檢測(cè)目的蛋白的一種分子生物學(xué)技術(shù)。  

免疫印跡(immunoblotting)又稱蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)，它是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合檢測(cè)復(fù)雜樣品中的某種蛋白的方法。該法是在凝膠電泳和固相免疫測(cè)定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新的免疫生化技術(shù)。由于免疫印跡具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫測(cè)定的高特異性和敏感性，現(xiàn)已成為蛋白分析的一種常規(guī)技術(shù)。免疫印跡常用于鑒定某種蛋白，并能對(duì)蛋白進(jìn)行定性和半定量分析。

我司為您提供全套免疫印跡(immunoblotting)技術(shù)服務(wù)，全部實(shí)驗(yàn)皆使用高質(zhì)量試劑完成

●主要實(shí)驗(yàn)步驟如下：  

1. 蛋白質(zhì)抽提

   a.實(shí)驗(yàn)對(duì)象為組織樣品，取適量（250~500mg）新鮮組織樣品或正確保存的組織樣品，加1ml含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑（或核蛋白抽提試劑），勻漿后抽提總蛋白（或核蛋白）。

   b.實(shí)驗(yàn)對(duì)象為細(xì)胞樣品，每份樣品取1×106～1×107細(xì)胞，PBS清洗細(xì)胞，去PBS加0.1ml~1ml含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑（或核蛋白抽提試劑）抽提總蛋白（或核蛋白）。  

2. 蛋白質(zhì)定量

   按KCTMBCA蛋白質(zhì)定量試劑盒操作說(shuō)明操作，測(cè)定樣品濃度。

3. 變性聚丙烯酰胺不連續(xù)凝膠電泳(SDS-PAGE)  

   將準(zhǔn)備好的樣品液和生物素標(biāo)記的蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)分別上樣，標(biāo)準(zhǔn)加進(jìn)第一個(gè)孔中，電泳分離蛋白。

4. 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜或PVDF膜

   按Bio-Rad蛋白轉(zhuǎn)移裝置說(shuō)明組裝濾紙凝膠纖維素夾層，30mA恒流條件下，4°C轉(zhuǎn)移過(guò)夜。

5. 膜的封閉和抗體孵育

   a. 膜在5％BSA溶液中室溫孵育1小時(shí)以封閉膜上的非特異結(jié)合。

   b. 封閉過(guò)的膜加入一級(jí)抗體室溫孵育1.5小時(shí)，抗原抗體結(jié)合。  

   c. 加入HRP標(biāo)記的二級(jí)抗體以結(jié)合一級(jí)抗體及HRP標(biāo)記的抗生物素抗體以結(jié)合分子量標(biāo)準(zhǔn)，室溫孵育膜1小時(shí)。加入HRP標(biāo)記的GAPDH抗體可同時(shí)檢測(cè)GAPDH含量。

6. 結(jié)果檢測(cè)

   化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，膜與化學(xué)發(fā)光底物孵育，經(jīng)X膠片曝光顯影。圖片掃描保存為電腦文件，并用ImageJ分析軟件將圖片上每個(gè)特異條帶灰度值的數(shù)字化。

7. 數(shù)據(jù)分析

   目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參GAPDF的灰度值以校正誤差，所得結(jié)果代表某樣品的目的蛋白相對(duì)含量。

8. 提供實(shí)驗(yàn)報(bào)告

   包括詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方法及免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果的相關(guān)圖表。

客戶方需提供：

1、 第一抗體(建議客戶定購(gòu)國(guó)外公司的一抗，以國(guó)外文獻(xiàn)中應(yīng)用的相關(guān)第一抗體為佳。

   如Cell signaling technology, Cayman Chemical, Santan Cruz, Zymed等著名抗體公司。)

2、 預(yù)實(shí)驗(yàn)樣本

3、 正式實(shí)驗(yàn)樣本

   同時(shí)希望客戶能提供相應(yīng)的背景材料以利實(shí)驗(yàn)順利完成，背景材料包括：樣本描述，目的蛋白相關(guān)資料，必要的相關(guān)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)內(nèi)容如陽(yáng)性對(duì)照等等。

★ 公司方提供：

1、 預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2、 正式實(shí)驗(yàn)結(jié)果

  如客戶只需要進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)研究，我方可只代理預(yù)實(shí)驗(yàn)業(yè)務(wù)并提供結(jié)果。

★ 實(shí)驗(yàn)周期與費(fèi)用：

   預(yù)實(shí)驗(yàn)的費(fèi)用以欲檢測(cè)目的蛋白的種類數(shù)目（或第一抗體種類數(shù)目）計(jì)算，公司將在材料和實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)全部到位的工作日后15個(gè)工作日之內(nèi)提交實(shí)驗(yàn)結(jié)果。正式實(shí)驗(yàn)費(fèi)用欲檢測(cè)目的蛋白的種類數(shù)目（或第一抗體種類數(shù)目）和樣本數(shù)為單位計(jì)算，實(shí)驗(yàn)周期為20個(gè)工作日，公司將在材料和預(yù)付的實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)全部到位的工作日后20個(gè)工作日之內(nèi)提交實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如客戶要求在10個(gè)工作日之內(nèi)完成，每單位樣品費(fèi)用為常規(guī)周期的兩倍。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以膠片的形式提交給客戶，客戶需在收到實(shí)驗(yàn)結(jié)果后一周內(nèi)付清所有剩余款項(xiàng)。